Hari Sutioso ( 0806460484 )
Khairul Hadi (0806460515 )
Khotib Sarbini ( 0806340113 )
Yongki Suharya D (0806460603)
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi.
HPLC berupaya untuk memisahkan molekulberdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padattertentu.
Fasa stationer
Fasa Gerak
Padat
Cair
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecildan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolomsederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (danmungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melaluikolom akan melekat lebih lama pada silika yang polardibanding degan senyawa-senyawa non polar. Olehkarena itu, senyawa yang non polar kemudian akanlebih cepat melewati kolom.
Ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasimenjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantaihidrokarbon panjang pada permukaannya secarasederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18.
Pelarut polar digunakan berupa campuran air danalkohol seperti metanol.
Air mengandung buffer atau garam untuk membantudalam pemisahan komponen analit.
Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakandalam HPLC.
Solventreservoir
Pump toproduce highpressure
Sampleinjection
HPLC tube
detector
Signal toprocessor
waste
Processing unit anddisplay
Injeksi sampelInjeksi sample seluruhnya otomatis. Terjadi padatingkat dasar dan jauh lebih rumit, karena proses inimeliputi tekanan, tidak sama halnya dengankromatografi gas.
Waktu retensiAdalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melaluikolom menuju detektor .Waktu retensi diukur berdasarkan waktudimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggianpuncak yang maksimum dari senyawa itu.
Waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alirdari pelarut)
Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapijuga pada ukuran partikel)
Komposisi yang tepat dari pelarut
Temperatur pada kolom.
DetektorUmumnya, penggunaan serapan ultra-violet (UV)sebagai detector pada HPLC.
UV being absorbedby compound (s) inthe mixture
UV
detector
Output from thecolumn
UV light
Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satusenyawa dalam campuran yang melalui detektor danmenerap sinar UV.
Penggunaan waktu retensi untuk membantumengidentifikasi senyawa yang diperoleh ( sepanjangdilakukan kontrol terhadap kolom)
Penggunaan puncak sebagai jalan untuk mengukurkuantitas dari senyawa yang dihasilkan.
Meihat waktu retensi dari senyawa tersebut
Hubungan jumlah dari senyawa X dengan puncak darisenyawa yang dihasilkan.
Area ( warna hijau ) yang berada dibawah puncaksebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, danarea ini dapat dihitung secara otomatis melalui layarkomputer.
Senyawa murni
Senyawa murni(kurang pekat)
Merupakan suatu metode analisis kimia yangbertujuan untuk memisahkan suatu jenis ionik denganmenggunakan muatan dan gaya friksionalnya. Teknikpenerapannya melibatkan suatu pipa kapiler denganlebar 20-200 µm dengan efisiensi pemisahan tinggibaik untuk molekul besar maupun kecil.
Kolom kapiler (dengan silika, jendela optis agarbisa diamati prosesnya dari luar.
Dua buah elektroda
Power supply (bisa diatur untuk bertegangantinggi)
Detector (sinar UV)
Larutan buffer beserta dua buah tempatpenyimpanannya
Terminologi Elektroforesis
Pergeseran waktu (migration time) tm merupakan waktuyang dibutuhkan larutan untuk bergerak dari kolomkapiler menuju jendela detektor.
Hal-hal yang mempengaruhi mekanisme proses ialahmobilitas elektroforesis (electrophoretic mobility)µep(cm2/Vs), kecepatan elektroforesis (electrophoreticvelocity) vep(cm/s), dan besarnya medan listrik (electricfield strength) E (V/cm). Hubungannya dapat dilihat padapersamaan dibawah:
(1)
Kecepatan merupakan hasil kalkulasi dari membagiperpindahan waktu dengan jarak pipa kapiler dari detektor.
Mobilitas tergantung pada hasil pembagian antara kecepatandengan besar medan listrik. Ketinggian cairan sampel pada pipakapiler tergantung pada jenis buffer yang dipakai, kondisi pHdan temperatur.
Panjang pipa kapiler yaitu panjang menuju detektor (Ld), danpanjang total (Lt), panjang ketika proses separasi terjadi padasegmen kapiler, Ld , dan panjang keselurahan adalah Lt, selisihatau kelebihan Lt terhadap Ld harus diketahui untukmenghubungkan pipa kapiler pada buffer reservoir. Pada sistemP/ACE excees panjangnya bernilai 7 cm, dengan ukuran panjangini apabila susunan pipa tersebut dibalikkan maka akan terjadisuatu separasi yang cepat.
Elektroosmosis
Merupakan proses dasar yang mengendalikan CE, peristiwa ini merupakanhasil dari terdapatnya muatan pada dinding pipa kapiler.
Aliran elektroosmosis didefenisikan dalam persamaan dibawah:
(2)
Dimana є adalah konstanta dielektrik, η adalah viskositas larutan buffer ,dan ζ adalah potensial zeta diukur pada saat bidang pembatas menutuppada hubungan permukaan antara liquid dan padatan.
Muatan negatif dinding menarik muatan positif ion dari larutan buffer,menghasilkan dua lapisan elektrik. Ketika tegangan yang dilibatkanmelewati pipa kapiler, kation yang ada didalam jumlah yang panjang(banyak)pada lapisan ganda (double layer), berpindah secara langsungkadalam katoda dengan mengikutsertakan air. Hasilnya adalah jaringanaliran larutan buffer pada elektroda negatif. Meningkatnya konsentrasiakan mengakibatkan aliran elektroosmosisnya menjadi menurun.
Pada gambar 2 diatas, diperlihatkan pengaruh pH terhadapEOF, ion zwiter seperti peptida telah dipisahkan kedalam duakondisi pH, pada pH tinggi EOF besar dan peptida bermuatannegatif sehingga perpindahan elektroforesis menuju kearahelektroda positif (anoda),
Dinamika aliran, efisiensi, dan resolusi
Pada saat aliran pada pipa kapiler diberikan suatu pendorong yaitutekanan maka akan terlihat perbedaan kecepatan aliran yaitu padalintasan tengah pipa lebih cepat dibanding dengan pada dinding, halini terjadi karena ada gaya friksional(gesek) liquid terhadap dindingkapiler (sistem hidrodinamik). Gambar bagian atas menunjukkansistem yang dikendalikan secara elektris, gaya dorong pada EOFterdistribusi secara uniform(merata) sepanjang pipa tersebut,sehingga tidak ada pengaruh tekanan, distribusi kecepatan meratakecuali pada bagian yang dekat sekali pada dinding pipa kapiler.
Nilai kecepatan aliran dapat ditentukan berdasarkan persamaan dasar:
Waktu yang dibutuhkan untuk berpindah (migration time)ialah:
(3)
(4)
Sepanjang berpindah , terjadi difusi molekular kemudianmemuncak pada dispersi, persamaan dispersi sebagai berikut:
(5)
Dimana Dm adalah koefesien difusi larutan cm2/s
Angka teoritis pelat alas diberikan dalam persamaan sebagaiberikut:
Mensubtitusikan persamaan 5 kedalam persamaan 6
(6)
(7)
Diameter Kapiler dan Panas Joule
Penggunaan tegangan listrik yang tinggi mengakibatkanterdapatnya panas yang terhimpun dalam sistem. Ada dua masalahyang cukup besar yang timbul sebagai akibat dari panas yangdihasilkan, yaitu gradien temperatur yang melintasi kolom kapilerdan pertukaran temperatur dalam beberapa waktu menjadi tidakefektif terhadap panas yang hilang.
Kecepatan panas yang dihasilkan pada kolom kapiler dapatditinjau melalui pendekatan persamaan sebagai berikut
(8)
Dimana L adalah panjang pipa kapiler, A adalah luas area yangdialiri. Apabila i=VR dan R=L/kA sedangkan k adalahkoduktivitas maka:
(9)
Gradien temperatur yang melintas pada kolom kapiler merupakanakibat dari dissipasi panas, temperatur pada aliran tengah kolomkapiler lebih tinggi dibandingkan dengan temperatur pada dindingkapiler.
Viskositas akan menjadi lebih rendah pada saat temperatur tinggi,dalam kondisi ini pula EOF dan mobilitas elektroforesis (EPM) jugaakan meningkat.
Gradien temperatur sebanding dengan kuadrat diameter daripipa kapiler, dapat dilihat melalui persamaan dibawah:
(10)
Diman W adalah usaha, r merupakan jari-jari kapiler, dan Kadalah konduktivitas termal.
Efek Tegangan dan Temperatur
Aliran elektroosmosis dan kecepatan elektroforesis sebanding dengankuatnya medan listrik, sehingga pemberian tegangan begitu tinggi akanmempercepat proses separasi, umumnya proses separasi terjadi pada kondisitemperatur 25oC (mendekati suhu kamar). Dengan mendinginnya liquidpada kolom kapiler, maka akan mudah untuk melakukan pengontrolantemperatur, pada saat buffer yang digunakan tersebut berkonsentrasi tinggidan dengan lebar pipa kapiler yang agak besar. Ketika terdapat masalahdalam melakukan pengontrolan temperatur maka solusi yang biasaditempuh adalah dengan menggunakan pipa kapiler yang lebih kecil, karenahal itu bisa menekan pemakaian arus dan mengurangi panas.
Metoda Injeksi Sampel
Metode-metode Elektroforesis kolom kapiler
Capillary Zone Electrophoresis
Isoelectric Focusing
Capillary Gel Electrophoresis
Isotachophoresis
Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography
Capillary Zone Electrophoresis (CZE)
Merupakan metode yang paling sederhana dari CE, mekanismeseparasinya berdasarkan pada perbedaan rasio muatan-massa.Dasar-dasar CZE adalah keseragaman larutan buffer dan besarnyamedan listrik yang tetap pada sepanjang kolom(pipa) kapiler.
Komponen-komponen sampel terpisah menjadi zona-zona khususyang bisa diamati pada gambar dibawah, untuk menentukanmobilitas elektroforesisnya maka digunakan persamaan dari teoriDebeye-Huckel-Henry
(11)
Dengan q adalah muatan netto, R jari-jari Stokes, dan η adalahviskositas.
Separasi molekul-molekul kecil dan besar dapat dilakukan dengan baikdengan metode CZE. Meskipun pada molekul yang lumayan kecil dimanarasio antara muatan dan massanya tidak begitu bagus.
Aplikasi
CZE sangat berguna untuk men-separasi protein dan peptide, hasil yangdidapat akan dianalisa perbedaannya berdasarkan satu subtituent dariasam amino. Hal ini berguna dalam memetakan tempat modifikasimutasi dan post-translasi yang terdeteksi.
Isoelectric focusing (IEF)
Perpindahan(pergerakan) cairan pada pipa kapiler akan terusberlangsung sepanjang larutan memiliki muatan atau diberimuatan, apabila kondisi sudah menjadi netral maka cairan akanberhenti bergerak.
Aplikasi
IEF berguna untuk menentukan pI dari protein, terutama dalammemisahkan immunoglobulin , variasi hemoglobin dan menentukanposisi translational modifikasi dari protein rekombinan, separasicampuran protein dapat dilihat pada gambar dibawah:
Capillary Gel Electrophoresis
Metode seperti ini dilakukan dengan melibatkan gel, geldiisikan kedalam pipa kapiler contohnya polyacrylamida, danagarosa. Metode ini penting diterapkan pada saat melakukanseparasi DNA.
Aplikasi
•DNA
Pemisahan oligonucleotida dan sekuen produk DNA melibatkan agarpolyacrylamide, gambar dibawah menunjukkan hasil separasi
Isotachophoresis
Pada metode ini aliran elektroosmosis sama dengan 0, sistem padabuffer adalah heterogen, pipa kapiler diisi dengan larutan elektrolityang memiliki mobilitas tinggi dibandingkan sampel-sampelnya yangakan diteliti sebagai leading , kemudian sampel diinjeksi, kemudianlarutan elektrolit kembali dimasukkan kembali sebagai terminating.
Micellar Electrokinetic CapillaryChromatography
Micellar merupakan agregat molekul yang ampifilik yang dikenal sebagaisurfaktan, micelle berkemampuan untuk menganalisis analit pada levelmolekular berdasarkan interaksi hidrofobik dan elektrostatik.
Aplikasi
